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真核表达载体构建

¥1 - 3000
2021-06-04 13:58

天津津科生物科技有限责任公司

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天津津科生物科技有限责任公司
薛经理
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产品属性
提供商 天津今年科生物科技有限责任公司
服务名称 真核表达载体构建
产品说明
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,Mg2+ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠杆菌连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步:首先,T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物;然后,酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法,为了防止载体本身的自连,可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下,粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。

操作步骤
1. 目的DNA的扩增和纯化;
2. 连接反应;
3. 电泳检测连接产物。
 
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