规格 | 100管/48样 |
规格 | 50管/24样 |
保质期 | 6个月 |
几丁质酶活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
货 号 :YX-W-B616
规格:100T/48S
产品内容:
提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 15mL×1 瓶,4℃保存,使用前摇匀。试剂二:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。
标准品:粉剂×1 瓶。5mg N-乙酰氨基葡萄糖,4℃保存。临用前加入 2.27mL 蒸馏水配成
10μmol/mL 的标准溶液。
产品说明:
几丁质酶要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨),以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解,具有抵御真菌侵染的作用,成为抗真菌病害的研究热点。
几丁质酶水解几丁质产生 N-乙酰氨基葡萄糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸产生棕红色化合物, 在 540nm 处有特征吸收峰,吸收值增加速率反映了几丁质酶的活性。
自备实验用品及仪器
天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤:
一、粗酶液提取
1.组织:按照组织质量(g):提取液体积 (mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入
1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃离心 20min,取上清,置冰上待测。
2.真菌:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3s,间隔 7 s,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 20min,取上清置于冰上待检。
3.培养液:直接测定。二、测定操作表
1、可见分光光度计/酶标仪预热 30min。波长调至 540nm,蒸馏水调零。
2、将标准溶液稀释为 5、4、3、2、1μmol/mL 的标准溶液备用。
3、在 EP 管中分别加入:
试剂名称 测定管 对照管 标准管 空白管
样品(μL) 100 100 - -
标准溶液(μL) - - 100 -
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蒸馏水(μL) - - - 100
试剂一(μL) 100 - 100 100
混匀,37℃水浴 1h,沸水浴 5min。
试剂一(μL) - 100 - -
8000rpm 常温离心 10min,分别取上清液 160μL 于新的 EP 管中,再加入下列试剂
试剂二(μL) 40 40 40 40
混匀,沸水浴反应 10min,立即置于冰上至室温。于微量玻璃比色皿或 96 孔板中测定每管在 540nm 下的吸光度,记为 A 测定管、A 对照管、A 标准管、A 空白管。计算ΔA 测定=A 测定管-A 对照管,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。
三、计算公式
1、标准曲线的绘制:
以ΔA 标准为 y 轴,标准溶液浓度为 x 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y=kx+b。将ΔA 测定带入标准方程中,得到 x(μmol/mL)
2、几丁质酶活的计算:
(1)按照样本重量计算
酶活性定义:37℃下,每 g 组织每小时分解几丁质产生 1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性(U/g 鲜重)=x×V 样÷(V 样÷V 样总×W)÷T=x÷W。
(2)按照蛋白质浓度计算
酶活性定义:37℃下,每 mg 蛋白每小时分解几丁质产生 1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性(U/mg prot)=x×V 样÷(V 样×Cpr)÷T =x÷Cpr。
(3)按照细胞数量计算
酶活性定义:37℃下,每 104 个细胞每小时分解几丁质产生 1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性(U/104 cell)=x×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量)÷T =x÷细胞数量。
(4)按照培养液体积计算
酶活性定义:37℃下,每 mL 培养液每小时分解几丁质产生 1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性(U/mL)=x×V 样÷V 样÷T =x。
V 样:反应体系中样本体积,0.1mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;
Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,1h;细胞数量:以万计。
注意事项:
1、反应结束后尽快进行比色。
2、OD 值大于 1.5,样品适当稀释再测定,注意计算公式里乘以稀释倍数;或者缩短 37℃水浴时间到X 小时(如 0.5 小时),按照原先计算公式得到的结果再除以 X。