提供商 | 上海强耀生物科技有限公司 |
服务名称 | 引物合成 |
目前引物合成基本采用固相亚-磷酰胺三酯法。 亚-磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。 亚-磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三-氯-乙酸反应,脱去其5′-羟基的保护基团DMT,获得游离的5′-羟基。 第二步,合成DNA的原料,亚-磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚-磷酸活化中间体,它的3′端被活化,5′-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。 第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%),用乙-酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在后续环节根据实验需要来选择纯化方式分离掉。 第四步,在氧化剂碘的作用下,亚-磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。 再以三-氯-乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。 合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨-水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。
严格的质量监控,高纯度的品质保证: 强耀生物拥有多种合成仪器,其中以BLP平台为主导,用于高通量的合成并搭配SpectraMax,全程监控合成的效率;此外我公司还有 ABI 3900和BioAutomation,可以大规模合成,专门用于一些特殊目的的合成。 除此之外,公司拥有多种型号的高效液相色谱仪,一次制备量可满足50nmol-50umol的合成级别,纯度可达到95%以上。
普通引物48小时内出货, 国内1-2天到货。 (DSL和OPC纯化引物(60base以下)发货时间一般1-2天;PAGE和HPLC纯化引物发货时间一般2-3天;修饰引物5-7发货时间一般为3-5天) *均为工作日 公司采用气相氨解仪进行氨解,采用高温高压氨-气进行氨解,避开了普通氨-水氨解,加快了氨解速度,减少了氨-水氨解过程中微量物质的残留和污染,将对引物的损害降低到了最低程度;另外我们的氨解采用自动控制,减少了氨解过程中的偶然偏差。
DSL纯化/ C18脱盐纯化; OPC纯化; PAGE纯化; HPLC纯化; 采用冻干技术,产品稳定性高: OD合成量高的引物,我们采用冻干技术,相比同行的真空加热干燥,可以很大程度减少对产品的损伤;冻干的引物在-20°C能够稳定长达一年,在4度能够稳定几个月。
我公司可以提供多种高品质荧光修饰,包括双标记荧光探针,稀有碱基,硫代修饰,磷酸基团,各种荧光集团修饰,生物素等。
随时为您解答引物出现的任何问题。
纯化方式 | 纯化原理 | 优点 | 缺点 | 适用范围 |
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DSL纯化 | 采用最新的biolytic气象氨解仪,在高纯氨-气水蒸汽混合物的气相氨解环境下将连接在CPG上的引物切割洗脱下来,能有效地去除盐分,经过有机溶剂的梯度洗脱能去除部分的杂质。 | 相比传统的液相氨解高效,快速,无交叉污染,所有纯化方法中最简单的一种。 | 不能有效去除比目的片段短的小片段,前提是合成效果很好时才能选用此法。 | PCR扩增、亚克隆、点突变、全基因合成及DNA测序等。 |
OPC 纯化 | 利用OPC柱中装有对DMT基团具有特殊亲和力的树脂,合成DNA片段时保留5’端最后一个碱基上的DMT,所有合成产物吸附在OPC柱上以后,用稀的有机溶剂洗柱,带有DMT片段的吸附能力强,不易被洗脱,不带有DMT的片段吸附能力弱从而被洗脱,然后用酸脱去吸附在OPC柱上DNA的DMT,再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。 | 方便、快捷 | 其专一性吸附DMT能力有限,不免仍然有短片段带入的可能,而且负载量小,特别是对长于40个碱基以上的 片段纯化效果不好 | PCR,引物的关键在于5′序列 如限制性酶切位点;指定位点突变;合成文库时的第一条链cDNA合成;克隆接头的产生。 |
PAGE 纯化 | 利用不同长度序列DNA在凝胶中迁移率不同来分离目标序列和失败序列,从而提供高纯度的目标引物。 对长链引物(大于40 mer)的纯化特别有效。本公司采用和C18反相柱连用,毛细管电泳,纯度大于85%。 | 纯化效果好,尤其是纯化长链效果好。 | 自动化程度低,纯化过程中引物损耗较大,发货周期相对较长。 | 40 mer以上的普通引物的纯化最有效方式;用于定点突变、克隆;蛋白结合凝胶迁移电泳分析、治疗与诊断用途。 |
HPLC 纯化 | HPLC根据吸附介质分为反相柱和离子柱。反相柱是根据疏水性的差别来分离的,即疏水性更强的长片段比短片段吸附能力更强,后出峰;离子柱上根据不同长度寡核苷酸带有不同净电荷,较长的片段带有高电荷比带有电荷低的短片段在离子柱内流动得慢,从而依次将不同片段洗脱出来。 | 自动化程度高,省人力,纯化效果好,纯度可达 99%以上,特别是在标记引物和特殊修饰探针纯化中效 果好。 | 纯化量小,不能纯化长片段,设备昂贵。 | <50 mer的普通引物的纯化,用于定点突变、克隆、蛋白结合凝胶迁移电泳分析、治疗用途;修饰引物的纯化;商业化的诊断引物或探针。 |