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​CUTANA™ ChIC / CUT&RUN Kit 快速入门

2024年04月18日 17:36   生物.医药.天然产物  

深圳欣博盛生物科技有限公司 发布 访问商铺

CUTANA™ ChIC / CUT&RUN Kit 快速入门

Kit v4 - Manual v4.0


CUTANA™ ChIC / CUT&RUN Kit 快速入门

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第一天

第一部分:CUT&RUN缓冲液的制备(约30分钟)

1. 按下表所述配制缓冲液。

注意:应根据完整手册附录1.1中的说明,根据细胞类型优化Digitonin(洋地黄皂苷) 的用量。

缓冲液名称

组分

1 RXN

8 RXN

16 RXN

保存

Wash Buffer

Pre-Wash Buffer

1.8 mL

14.4 mL

28.8 mL

室温,供第一天使用

25× Protease Inhibitor

72 μL

576 μL

1.15 mL

1M Spermidine

0.9 μL

7.2 μL

14.4 μL

Cell Permeabilization Buffer

Wash Buffer

1.4 mL

11.2 mL

22.4 mL

4℃,供第2天使用

5% Digitonin

2.8 μL

22.4 μL

44.8 μL

Antibody Buffer

Cell Perm. Buffer

100 μL

800 μL

1.6 mL

冰上,供第1天使用

0.5M EDTA

0.4 μL

3.2 μL

6.4 μL

注意:以下流程皆按单个样本计算,请根据实际样本数量等比例配制

第二部分:ConA磁珠活化(约30分钟)

2. 轻轻重悬ConA磁珠,取11 µL至1.5 mL离心管中。

3. 将离心管放在磁力架上,使溶液澄清;用移液器去除上清液。

4. 从磁力架上取下离心管。立即加入100 μL冷的Bead Activation Buffer,并用移液器将磁珠充分重悬。将离心管放回磁力架,使溶液澄清,用移液器去除上清液;此步骤重复一次。

5. 加入11 µL冷的Bead Activation Buffer重悬磁珠。

6. 按照10 µL/管的量,将磁珠等分到8联排管中;置于冰上。

 

第三部分:细胞与活化磁珠结合(约30分钟)

7. 计数起始细胞并确认其完整性和活力。每样本使用500,000个细胞(可多加10%)。

8. 室温下以600×g的转速离心3分钟,用移液器去除上清液。

9. 用100 µL的Wash Buffer重悬细胞。室温下以600×g的转速离心3分钟,用移液器去除上清液;此步骤重复一次。

10. 用105 µL的Wash Buffer重悬细胞。对制备好的细胞进行计数并检查其完整性。

11. 将 100 µL 细胞转移到含有10 µL 活化 ConA 磁珠的8联排管中。轻轻涡旋重悬,短暂快速离心,将磁珠收集到管底部。

12. 室温孵育10分钟,使细胞吸附到磁珠上。

13. 如果使用多通道移液器,请将试剂槽置于冰上,注入冷的Antibody Buffer注意:一次取出并更换一条8联排管的缓冲液,以避免 ConA 磁珠变干和样品丢失。

14. 将离心管放在磁力架上,使溶液澄清,用移液器去除上清液。保存10 µL上清液用于台盼蓝染色,以确定上清液中没有细胞(可依据完整手册附录1.2)。

15. 从磁力架上取下离心管。立即加入50µL冷的Antibody Buffer并用移液器吹吸重悬。取 10 µL重悬样品以确认细胞结合到了ConA磁珠上(可依据完整手册附录1.2)。

 

第四部分:抗体结合(约30min +过夜)

16. 瞬时离心K-MetStat Panel原液并用移液器吹吸混匀(切勿涡旋)。在指定用于H3K4me3和IgG对照抗体的反应中,加入2 µL K-MetStat Panel并涡旋混匀。注意:如果使用的细胞数少于500000个,请按照完整手册第16页的说明减少K-MetStat Panel的量。

17. 每个样品加入0.5 µg抗体。对于指定的对照反应,加入1µL IgGH3K4me3对照抗体。轻轻涡旋混匀。

18. 在4ºC条件下,置于旋转混匀仪(nutator)上孵育过夜,管盖稍稍抬高。切勿翻转离心管。

 

第二天

第五部分:pAG-MNase结合(约40 min)

19. 将试剂槽放在冰上,注入冷的Cell Perm. Buffer

20. 将离心管从4℃条件下取出,瞬时离心收集液体。注意:磁珠过夜可能沉淀,属正常现象。

21. 将离心管置于磁力架上,使溶液澄清,去除上清液。

22. 将离心管保留在磁力架上。每管加入200µL冷的Cell Perm. Buffer,用移液器去除上清液;此步骤重复一次。

23. 从磁力架上取下离心管。每管加入50µL冷的Cell Perm. Buffer,轻轻涡旋混匀。注意:磁珠在这个阶段可能会结块,可用移液器轻柔吹吸,使结块分散。

24. 每管加入2.5µL pAG-MNase。轻轻旋涡或用移液器吹吸,以重悬磁珠并使酶均匀分布。

25. 室温孵育10分钟。

26. 瞬时离心后,置于磁力架上,使溶液澄清,去除上清液。

27. 将离心管保留在磁力架上。每管加入200µL冷的Cell Perm. Buffer,用移液器去除上清液;此步骤重复一次。

28. 从磁力架上取下离心管。每管加入50µL冷的Cell Perm. Buffer。用移液器轻轻吹吸混匀、分散团块。

 

第六部分:目标染色质片段化(约3小时)

29. 将离心管置于冰上。每管加入1 μL 100 mM的氯化钙,轻轻涡旋或用移液器吹吸均匀。

30. 将离心管(管盖略微抬高)放在旋转混匀仪上4ºC孵育 2 小时。

31. 制备终止液:取1µL E. coli Spike-in DNA与33µL Stop Buffer混合(单个反应用量)。轻轻旋涡混匀。注意:如果使用的细胞数少于500,000个,请按照完整手册附录2中的说明稀释E. coli Spike-in DNA。

32. 孵育结束后,向每个反应中加入34 μL终止液,轻轻旋涡混匀。

33. 将反应离心管置于37℃热循环仪中,孵育10分钟。

34. 瞬时离心后,置于磁力架上,使溶液澄清。将含有DNA富集产物的上清液转移到新的8联排管中。丢弃含有ConA磁珠的离心管。

 

第七部分:DNA纯化(约30分钟)

35. 用无水乙醇(EtOH)和分子生物学级别的水制备85%乙醇(EtOH)(现用现配)。

36. 重悬SPRIselect试剂(Beckman Coulter, Inc),向每个反应管中缓慢加入119 µL。

37. 轻轻旋涡混匀,瞬时离心以收集液体。室温孵育5分钟。

38. 将离心管放在磁力架上2-5分钟。用移液器去除上清液,不要用移液管吸头搅动磁珠。

39. 将离心管保留在磁力架上。每管加入 180 µL 85% EtOH,用移液器去除上清液;此步骤重复一次。

40. 瞬时离心,管盖朝内,使磁珠留在离心管一侧。将离心管放回磁力架上,去除残留的EtOH。

41. 从磁力架上取下离心管,打开管盖。室温风干磁珠2-3分钟或直到液体蒸发,但磁珠仍然呈现潮湿的哑光棕色。如果磁珠有裂纹或呈浅棕色,说明过于干燥。

42. 每管加入17 µL 0.1X TE buffer洗脱DNA。

43. 涡旋重悬磁珠,室温孵育2分钟。

44. 将离心管置于磁力架上2分钟。将15µL CUT&RUN DNA转移到新的8联排管中。

45. 使用Qubit荧光仪对1 μL DNA进行浓度测定。继续文库制备或将DNA保存在-20ºC。

 

关于预期结果,可参阅完整手册。切勿使用TapeStation/Bioanalyzer检测 CUT&RUN DNA。DNA的产量太低,无法在这些平台上进行检测,而且在实验步骤的这一步也无法提供有用的信息。可等到文库制备后再检查片段分布。

 

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本文翻译自链接https://www.epicypher.com/content/documents/manuals/cut-and-run-kit-quick-card.pdf,如与原文有出入的地方,请以英文原文为准。

未经EpiCypher公司事先书面同意,本文件不得部分或全部复制。

 

关于EpiCypher公司:

EpiCypher是一家成立于2012年的表观遗传学公司。从专有组蛋白肽阵列平台EpiGold™开始,EpiCypher开发了一系列同类产品。同时,EpiCypher是重组核小体制造和开发的全球领导者。利用其独有技术,不断增加产品库中高纯度修饰重组核小体(dNucs™)产品。dNuc™多样性的产品为破译组蛋白编码和加速药物开发提供了强大的工具。

EpiCypher还将dNuc™技术广泛的应用于多种分析测定产品中,包括:SNAP-ChIP®Spike-in Controls(用于抗体分析和ChIP定量), EpiDyne®底物(用于染色质重塑和抑制剂筛选及开发),dCyher™测定(用于探究表观遗传蛋白质-组蛋白PTM结合相互作用)。最近,EpiCypher还推出了针对ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag的高灵敏度表观基因组图谱CUTANA™分析。



CUTANA™ ChIC / CUT&RUN Kit 快速入门

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