杂交瘤技术是一种应用广泛且最为经典的单克隆抗体制备技术，其操作流程为：将免疫后小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选具有特异性抗体分泌功能的杂交瘤细胞株，进而生产纯化获得单克隆抗体。下面是关于杂交瘤开发技术平台相关问答：

①电融合和PEG融合的区别？

PEG化学融合是利用聚乙二醇分子能够改变细胞膜结构的特性来实现细胞融合的过程。聚乙二醇可以使两个细胞接触点质膜的脂质分子发生疏散和重组，两个细胞接触部位的质膜由于相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而发生细胞融合。电融合则是先通过高频交流电压，使细胞成串珠状排列，实现点接触；然后施加方波脉冲，击穿两个细胞接触部位的质膜，质膜脂质分子发生重组，同时由于细胞表面张力作用，完成细胞融合。电融合法比PEG融合法有明显的优点：细胞融合率高，有利于杂交瘤的筛选；电脉冲击穿对细胞的损伤小，有利于融合后细胞的生长增殖；可直接观察融合过程；便于有目的地控制选择融合条件。

②为什么要使用核酸免疫？

重组蛋白由于免疫靶向明确、剂量可控等优势，通常作为动物免疫阶段的首选免疫原。但有些重组蛋白因为表达纯化困难，很难大量获得并用于动物免疫；另外，重组蛋白与天然样本之间存在或多少的结构差异。而核酸免疫，跳过了蛋白表达纯化的过程，成功避开了蛋白生产的难题，通过核酸体内表达的蛋白结构也更加接近天然蛋白，故而可以作为重组蛋白免疫的有效补充手段。但核酸免疫的免疫剂量很难判断，整体免疫效价也会普遍低于蛋白和多肽免疫。

③除弗氏佐剂之外，免疫佐剂还有哪些？

免疫佐剂是指那些同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。佐剂的免疫生物学作用是增强免疫原性、增强抗体的滴度、改变抗体产生的类型、引起或增强迟发超敏反应等。除经典的弗氏佐剂外，各类不同功能的佐剂也层出不穷，比较常见的有：1）无机佐剂，如磷酸铝佐剂、氢氧化铝佐剂；2）生物类佐剂，如以细菌胞壁或产物为主要组成的佐剂；3）具有佐剂活性的细胞因子类，如GSF、IL1、IL2、IFN -γ等；4）人工合成佐剂，如cpG等。

④杂交瘤融合后主克隆接种96孔细胞培养板数量通常是多少？

融合后的主克隆细胞接种96孔细胞培养板的数量与融合效率和脾细胞多少有密切关系。PEG化学融合后的主克隆，通常一只小鼠的脾细胞可以接种8-15块96孔细胞培养板；电融合因为融合效率大大提高，通常一只小鼠的脾细胞可以接种30~50块96孔细胞培养板。

⑤单克隆抗体制备对免疫原纯度有哪些要求？

鼠单抗制备要求蛋白抗原纯度90%以上，如果纯度过低，筛选所得的抗体有可能是与免疫原中无关杂质成分结合，不与目的靶点结合，抗体特异性差。

⑥单抗制备常用的小鼠品系是什么？

常规推荐使用6-8周雌性SPF级Balb/c小鼠进行免疫，如果客户有需求，也可以使用C57、SJL等小鼠品系进行免疫和单抗制备。

⑦IHC、FC、WB等功能抗体筛选过程中，主克隆及亚克隆阶段都需要介入筛选吗？

主克隆和亚克隆筛选阶段均需进行指定检测方法的介入筛选。主克隆阶段，分泌IHC、FC、WB等功能抗体的细胞与ELISA检测阳性的细胞相比，通常比例不高；主克隆阶段的介入检测，可以帮我们有目的性地保留相应功能的阳性抗体，提高筛选的效率和成功率。另外，由于主克隆阶段很可能是多克隆细胞，所以在亚克隆阶段，特别是第一次亚克隆筛选阶段，为降低分泌指定应用抗体的克隆筛选丢失，也建议进行相应功能的介入筛选。

⑧如果进行试剂盒配对检测，对筛选的鼠单抗有什么要求？

试剂盒检测首先需要抗体具有一定限度的检测灵敏度，相应地，在克隆筛选阶段，义翘神州会通过降低包被量、进行亲和力检测等方法，有目的性地保留亲和力相对较高的克隆进行后续实验。另外，为增加配对的成功率，建议尽可能保留10株以上源自于不同主克隆的亚克隆细胞进行抗体生产和配对检测。

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