常规细胞复苏培养以及转染步骤分享
关键词:细胞培养基,细胞复苏
1实验步骤
1.1细胞复苏:
细胞培养基:DMEM+10%FBS+1%(Penicillin-Streptomycin Solution)。
(1)将细胞从液氮中取出,快速放入37°C水浴锅中,轻摇冻存管使冻存液溶解;
(2)溶解后把细胞转移到含有5ml培养基的离心管中,离心收集细胞,室温1000rpm离心5 min,弃上清;
(3)用含10%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞,接种到培养皿中,轻轻吹打混匀,37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。
1.2细胞传代:
细胞的密度达到80%时,对细胞进行传代:
(1)弃去培养基,用PBS洗一遍;
(2)加1-2ml 0.25%胰蛋白酶消化细胞,显微镜下观察,消化1-2min,可看到细胞相互分离变圆,即消化完成;
(3)快速弃去胰酶,加入完全培养基,吹打细胞,制成单细胞悬液,按1:3的比例传代,37℃、5%CO2饱和湿度条件下扩大培养。
1.3细胞处理:
(1)取处于对数生长期,生长状态良好的细胞,以5×105个/孔接种于细胞培养6孔板,37℃、5%CO2培养箱中培养过夜;
(2)根据自己的分组要求,开始给药处理或者siRNA转染
1.4 siRNA转染:
转染前2小时,换成无血清培养基;
2)对于每个转染样品,均按下面的方法准备:
a)用10μl无血清opti-MEM稀释1μl siRNA(浓度为20μM),并用枪头轻轻混匀,室温下静置5分钟;
b)使用前轻轻混匀LipofectamineTM 2000,然后取0.5μl的LipofectamineTM 2000稀释在10μl opti-MEM中,室温下静置5分钟;(注意:要在30分钟内混合LipofectamineTM 2000和siRNA的稀释液);
c)室温下静置5分钟后,混合LipofectamineTM 2000和siRNA的稀释液(总体积为20μl),轻轻混匀并在室温下静置20分钟;
3)每个培养孔分别加混合液20μl,前后轻轻摇动细胞培养板使混合液与培养板中培养液混匀;
4)细胞于37℃CO2培养箱中培养,6h后吸出混合液换入正常培养基;
5)37℃、5%CO2培养箱中培养相应时间。
1.1细胞复苏:
细胞培养基:DMEM+10%FBS+1%(Penicillin-Streptomycin Solution)。
(1)将细胞从液氮中取出,快速放入37°C水浴锅中,轻摇冻存管使冻存液溶解;
(2)溶解后把细胞转移到含有5ml培养基的离心管中,离心收集细胞,室温1000rpm离心5 min,弃上清;
(3)用含10%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞,接种到培养皿中,轻轻吹打混匀,37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。
1.2细胞传代:
细胞的密度达到80%时,对细胞进行传代:
(1)弃去培养基,用PBS洗一遍;
(2)加1-2ml 0.25%胰蛋白酶消化细胞,显微镜下观察,消化1-2min,可看到细胞相互分离变圆,即消化完成;
(3)快速弃去胰酶,加入完全培养基,吹打细胞,制成单细胞悬液,按1:3的比例传代,37℃、5%CO2饱和湿度条件下扩大培养。
1.3细胞处理:
(1)取处于对数生长期,生长状态良好的细胞,以5×105个/孔接种于细胞培养6孔板,37℃、5%CO2培养箱中培养过夜;
(2)根据自己的分组要求,开始给药处理或者siRNA转染
1.4 siRNA转染:
转染前2小时,换成无血清培养基;
2)对于每个转染样品,均按下面的方法准备:
a)用10μl无血清opti-MEM稀释1μl siRNA(浓度为20μM),并用枪头轻轻混匀,室温下静置5分钟;
b)使用前轻轻混匀LipofectamineTM 2000,然后取0.5μl的LipofectamineTM 2000稀释在10μl opti-MEM中,室温下静置5分钟;(注意:要在30分钟内混合LipofectamineTM 2000和siRNA的稀释液);
c)室温下静置5分钟后,混合LipofectamineTM 2000和siRNA的稀释液(总体积为20μl),轻轻混匀并在室温下静置20分钟;
3)每个培养孔分别加混合液20μl,前后轻轻摇动细胞培养板使混合液与培养板中培养液混匀;
4)细胞于37℃CO2培养箱中培养,6h后吸出混合液换入正常培养基;
5)37℃、5%CO2培养箱中培养相应时间。
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