β-半乳糖苷酶的主要来源有：① 细菌、霉菌、酵母等微生物，其中细菌中的乳酸菌、大肠杆菌等，霉菌中的米曲霉、黑曲霉等，酵母中的脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母等，放线菌中的天蓝色链霉菌等；② 植物，尤其是杏、扁桃和苹果等；③ 哺乳动物，特别是幼小哺乳动物的小肠中。仅来源于微生物的β-半乳糖苷酶有工业应用价值，商业用酶源一般认为酵母（如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母） 最为安全，其次为黑曲霉。

不同来源的β-半乳糖苷酶最适pH 在4.0~7.5之间不等。最适pH 不同决定了来源不同的β-半乳糖苷酶各自的用途不同，如霉菌所产生的β-半乳糖苷酶的最适pH 偏酸性（pH 2.5~5.0），适用于酸性乳清和干酪的水解（含大量乳糖）；而酵母和细菌所产生的β-半乳糖苷酶的最适pH 近中性（分别为pH 6~7 和pH 6.5~7.5），适于牛乳（pH 6.6）和鲜乳清（pH 6.1）的水解。

β-半乳糖苷酶的最适作用温度范围较宽，在37~50 ℃之间。酵母β-半乳糖苷酶的最适作用温度在35 ℃左右；而霉菌的最适作用温度一般在50 ℃以上，最高可达60 ℃；环状芽抱杆菌可达65 ℃；嗜热水生菌则为80 ℃。耐高温微生物菌株使用时可避免杂菌污染，所以细菌尤其是嗜热细菌所产生的β-半乳糖苷酶正得到广泛的研究。

迄今，大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶研究得最彻底，并已大量应用于生化分析 。

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