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一种多快好省的蛋白表达技术

2022年11月17日 09:31   生物.医药.天然产物  

普健生物(武汉)科技有限公司 发布 访问商铺

关键词:蛋白;蛋白表达

近年来越来越多的重组蛋白(特别是人源化单克隆抗体)作为生物药应用于医疗。临床及实验室研究中,经常要求在短时间内生产一定量的重组蛋白。AtaGenix上周介绍的稳定表达细胞株生产重组蛋白过程繁琐,周期太长。作为其替代方法,瞬时基因表达技术则能在数周内生产数十甚至数百毫克重组蛋白,因而得到广泛应用。


那么,


它是如何做到的呢?


接下来AtaGenix将带您了解这项快速获取真核重组蛋白的神技——哺乳动物细胞瞬时表达技术(Transient Gene Expression,TGE)。

AtaGenix技术人员正在进行实验准备


哺乳动物细胞瞬时表达技术的奥妙主要集中在宿主细胞系、表达载体的最优化设计和转染条件的选择三个方面。


宿主细胞系

哺乳动物细胞作为宿主细胞的优势在于其翻译后修饰能力,如糖基化、磷酸化和二硫键正确折叠等,可使重组蛋白形成正确结构从而具有生物活性。瞬时表达中最常用的哺乳细胞是HEK293和CHO细胞及两者的亚系。

 

HEK293细胞

HEK293细胞生长于静止培养基时中度贴壁,每30 h传一代,最高生长密度可达2-5×106 cells/mL。它易于悬浮适应、无血清驯化。因其改造自人源细胞,表达人源重组蛋白药物时不会引起免疫反应,是TGE 中最常用的细胞系。有研究指出,HEK293细胞中瞬时表达的结果可用于预测重组蛋白在CHO细胞稳定表达的水平和质量。

 

CHO细胞

CHO细胞是最早建立的体外培养细胞系之一,作为生产药物蛋白的宿主细胞,它一直备受青睐。 到2012年为止,在美国及欧洲市场上 的28个抗体药物中有12个来自CHO细胞。CHO细胞本身粘附性强,需进行悬浮适应和无血清驯化,传代时间为18 h,细胞生长密度可达5×106-1×10cells/mL。虽然有报道称其糖基化方式与人体细胞略微不同,但鉴于CHO细胞在药物蛋白稳定生产方面的良好表现,工业上更倾向于在TGE工艺中使用CHO细胞家族。用于瞬时转染表达的CHO细胞都是CHO K1细胞系的子代细胞或DG44和DUK X B11的dhfr阴性变种,适应悬浮培养的CHO-S细胞由CHO K1细胞衍生而来。

 

HEK293 CHO细胞的改造亚系

早期研究发现,猴病毒40(SV40)和埃巴病毒(EBV)能维持其宿主细胞周质中的游离质粒拷贝数,并通过特有的病毒特性加强转录和翻译。对SV40来说,这种效果是由SV40大T抗原与其复制起点 SV40 ori 结合引起的。而源于EBV病毒的EBNA-1蛋白和oriP的结合以及小鼠多形瘤病毒大 T抗原与多形瘤复制起点Pyori的结合也起到类似的作用。基于这些发现,用建立稳定细胞系的方法对两种细胞进行改造,先后得了HEK293-T、HEK293-EBNA和293-6e以及CHO EBNA1c-3E7、CHO EBNALT和Expi-CHO等细胞亚系,分别可稳定表达EBNA-1、SV4大T抗原或小鼠多形瘤病毒T抗原。当转入的载体中携有能与这些蛋白相结合的复制起点时,游离态质粒的拷贝数将得以增加并维持,进而加强表达。


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HEK293和CHO

无血清悬浮细胞系,

各三种,

尽在AtaGenix,

供您选择~


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表达载体的最优化设计

哺乳动物细胞中基因表达受一系列事件影响,包括转录RNA加工、mRNA转运及降解、翻译、翻译后修饰及分泌(对于分泌蛋白)。设计载体时可通过添加及组合各种调控元件影响这些事件,使TGE蛋白表达最优化。


比如


AtaGenix

自主研发优化的

pATX1和pATX2载体,

不但具有自主知识产权,

而且表达效率高。



用事实说话

案例1-蛋白H在pATX1的表达


AtaGenix比较了pATX1和商业化pcDNA3.1对蛋白H的表达,结果显示蛋白在pcDNA3.1无表达,而在pATX1上表达成功,表达量为4.53 mg/L(纯化后)。

蛋白H 在不同载体上的表达

蛋白H 的纯化测试

蛋白H 的酶切


案例2-蛋白L在pATX2的表达


蛋白L存在两个糖基化位点,理论分子量为47.1 kDa。在pATX2上表达成功,表达后蛋白L实际分子量约为55 kDa,表达量为247.5 mg/L(纯化后)。


蛋白L 的表达

蛋白L 的纯化测试

蛋白L 的质量控制


转染条件的摸索

瞬时转染是TGE工艺非常关键的步骤,转染效率一定程度上决定了重组蛋白的表达水平。常用的转染试剂包括脂质体、磷酸钙及聚乙烯酰胺(PEI),可用于悬浮或贴壁培养的细胞,具有转化效率高,细胞毒性低等优点。脂质体价格昂贵不适合应用于转染规模通常在数百毫升以上的TGE工艺。磷酸钙介导转染应用较早,是除PEI外在大规模瞬时表达中应用最多的转染试剂,但磷酸钙会与悬浮培养基中防止细胞聚集的成分形成沉淀物,在转染前需要有换液过程,不适合大规模瞬时表达。


  因此,

我们只重点介绍


PEI介导的瞬时转染

哺乳动物细胞大规模TGE的成功一定程度上可归功于阳离子聚合物PEI的出现。PEI最早在基因治疗实验中作为DNA载体,工业上可大量生产,价格便宜,其中应用最普遍的是线性25 kDa PEI。


主要影响因素


影响PEI介导瞬时转染效率的因素主要包括DNA用量、DNA与PEI质量比以及转染时的细胞密度。DNA的最佳用量通常在1μg/10cells,其表达质粒用量极大,成为大规模TGE的主要成本之一。越来越多证据表明,用一定比例的填充DNA(如蜥蜴精子中的DNA)代替实际表达质粒并不会降低重组蛋白表达,同时可节省表达质粒用量。DNA与PEI的质量比应在1:2-1:3左右,太低影响转染效率,过高则可能造成较高的细胞毒性。转染时的细胞密度应达到 1-2×10cells/mL,而悬浮培养的HEK293和CHO细胞多生长在0.5-2×10cells/mL密度,转染前需经离心或沉降使细胞浓缩至合适密度。


其他因素

其他因素如DNA与PEI的混合孵育时间、转染试剂占总体积比曾被认为极为重要,但最近的研究表明直接按顺序加入DNA、PEI到细胞中,也得到类似的转染效率和表达量。此外某些商业化培养基中用以减少细胞聚集的葡萄糖硫酸酯以及用于替代转铁蛋白的柠檬酸铁都会阻碍PEI介导的瞬时转染。总体上看,PEI介导HEK293细胞系瞬时转染效率约为60%,而介导CHO细胞瞬时转染则相对困难。


AtaGenix主要采用

自己研发和优化的

PEI

商业化转染试剂。

PEI用于大规模生产。


下面是Atagenix采用优化的PEI转染试剂表达人源化单克隆抗体mAbA3实例,表达量为103 mg/L。

mAbA3 的表达纯化

mAbA3 的质量控制




怎么样,


如此丰富的案例,


有没有让你心动?




其实,


成为蛋白表达服务业的权威,


一直是普健生物的奋斗目标。


因此,


我们从不放弃探索与研究。




更多蛋白表达,


尽在AtaGenix。




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