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化解抑制剂在动物实验中的溶解难题-AbMole经验分享篇

2020年05月21日 13:10   化工日常

奥默生物技术(上海)有限公司 发布 访问商铺

关键字:抑制剂,激动剂

抑制剂/激动剂在动物体内的实验以其实验周期长、投入高、影响因素多、实验结果说明性强,而受到极大的重视。而抑制剂/激动剂的溶解作为整个实验的起始步骤,直接影响化合物在动物体内的吸收及效用的发挥。接下来,默默分别从4个方面与您分享如何获得动物实验可用的抑制剂/激动剂溶解体系,助大家发表高档次的文章。

化解抑制剂在动物实验中的溶解难题-AbMole经验分享篇

抑制剂不溶别着急,超人默来帮你啦

01 Part 1 助溶物特性

在进行抑制剂/激动剂溶液配置之前,我们先了解一下常用的抑制剂/激动剂助溶物。

1. 水溶液

水溶液与动物的生理环境更为接近,动物实验中所给抑制剂/激动剂的溶媒最好以水相为主,但考虑到药理活性,往往不会有很多水溶性特别好的化合物作为先导化合物,所以大部分化合物在水相中的溶解度满足不了动物实验的给药需求。

常用的水溶液包括:水、生理盐水、5%的葡萄糖水 (D5W)、pH 2-9的缓冲溶液 (buffer)。

2. 环糊精

环糊精属于抑制剂/激动剂包合剂,是一种具有亲水表面和一个疏水空腔的环状低聚糖,因而它能够提供一个疏水的结合部位,包络适当的客体化合物,如脂溶性化合物、水溶性不好的化合物,与抑制剂/激动剂形成水溶性更好的抑制剂/激动剂-环糊精包合体来提高抑制剂/激动剂的水溶性。

常用的环糊精:羟丙基-β-环糊精 (HP-β-CD) 和磺丁基-β-环糊精 (SBE-β-CD),相对于β-环糊精,其衍生物的溶血作用较弱,安全性更好,是目前被FDA批准的仅有的两种可注射型环糊精辅料,其中SBE-β-CD (Captisol,M4837) 的助溶效果优于HP-β-CD。

3.助溶剂

由于大部分抑制剂/激动剂不会具有特别好的水溶性,助溶剂能帮助一些水不溶的化合物在水中溶解。

常用的助溶剂:二甲基亚砜 (DMSO)、甲基-2-吡咯烷酮 (NMP)、二甲基乙酰胺 (DMA)、乙醇、聚乙二醇 (PEG300,M9292)、丙二醇 (PG)、异丙醇等。

4. 表面活性剂

表面活性剂除了加强抑制剂/激动剂溶解以外,还能使其颗粒湿润、分散,减少抑制剂/激动剂在体内体外稀释时的析出沉淀。

传统的表面活性剂有:吐温80、聚氧乙烯蓖麻油 (Cremophor EL,M9294) 等;

新型的表面活性剂有:甘油酯44/14、聚乙二醇硬脂酸酯15 (Solutol HS-15)。

新型比传统表面活性剂,助溶效果、生物相容性及安全性更好,所以现在常用Solutol HS-15替代吐温80。

5. 脂类

脂类可以有效的帮助脂溶性强的化合物溶解,常用的有豆油、辛酸/癸酸甘油三酯等。

02 Part 2 助溶物的选择

在了解过常用的抑制剂/激动剂溶解助溶物后,接下来需要考虑的是如何选择合适的助溶物配合辅助抑制剂/激动剂溶解。一般我们可以从需要溶解的化合物结构和给药方式两方面考虑。

1. 抑制剂/激动剂结构

常见的亲水基团:—OH、—CHO、—COOH、—NH2等;

常见的疏水基团:所有的烃基 (—CnH2n+1、—CH=CH2、—C6H5等)、卤原子 (—X)、硝基 (—NO2) 等;

常见的酸性基团:-COOH 、–OH、–SO3H等;

常见的碱性基团:-NR2等;

一般亲水基团多的化合物水溶性比疏水基团多的强;碱性基团多时,降低pH 可以提高溶解度,酸性反之,但注意不要使用对动物组织有刺激性的极端pH,合适的pH值范围为2-9。

考虑到助溶剂和表面活性剂等的毒性,首先考虑使用单一溶媒;若单一溶媒不能溶解时,再考虑配方中加入助溶剂和表面活性剂等。极性较大的助溶剂有DMSO、DMA和NMP等,极性稍小的助溶剂有乙醇、PG和PEG等。

2. 给药方式

常见的给药方式分为静脉注射、灌胃、腹腔注射、皮下注射,不同的给药方式可用剂型也有所不同:

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溶液剂:一般是非挥发性抑制剂/激动剂的澄明溶液,大多数以水为溶剂,少量用到油溶液。

乳剂:指互不相溶的两相液体,其中一相以小液滴状态分散于另一相液体中,形成非均匀分散的液体制剂。

混悬剂:一般指难溶性的固体抑制剂/激动剂以微粒的状态分散于分散介质中形成的非均质液体制剂,微粒的粒径(不是直径)一般在0.5-10μm之间。

固体制剂:固体制剂的种类繁多,主要包括片剂、颗粒剂等,约占抑制剂/激动剂制剂中的70%。

可根据给药方式选择合适的剂型及相应的助溶剂进行配制。

03 Part 3 溶液的配置步骤

1. 如果所用抑制剂/激动剂的动物实验溶解方法有文献可供参考,须提前准备好文献中需用到的各种助溶物,然后先称取少量化合物参照文献描述进行溶液配制(多数情况是先将有机溶剂加入化合物,混匀后再加水相定容到目的体积),可通过震荡、超声、加热等帮助溶解。如文献描述的溶解方法不能很好地溶解目的抑制剂/激动剂,需另行摸索更为适合的溶解方法。千万不要在未做溶解测试预实验前,将大规格(数百毫克甚至克级别)的抑制剂/激动剂一次性全部加入溶液!!

2. 如果所用抑制剂/激动剂的动物实验溶解方法没有文献可供参照,则需自行摸索适合的溶解方法。如下步骤可供参考:

第一步:尝试将抑制剂/激动剂溶于水或一定pH的缓冲溶液,若其能在给药体积允许的范围内溶解则直接用于给药,若不溶解则进一步尝试。

第二步:若上述方法不溶解,尝试将抑制剂/激动剂溶于乙醇、DMSO等有机溶剂(必要时调节溶液pH),一般情况下,抑制剂/激动剂可以溶于此类有机溶剂,对于在乙醇、DMSO中难以溶解的抑制剂/激动剂,可以进一步尝试玉米油等极性更弱的有机溶剂。在此之后用水稀释有机溶剂,确保制剂中DMSO的体积分数在20%以内,或乙醇的体积分数在10%以内,稀释前可加入适量的吐温80、Solutol等表面活性剂进一步增加抑制剂/激动剂在水中的溶解度。若稀释后抑制剂/激动剂未析出则可用于给药,若抑制剂/激动剂析出则进行下一步尝试。

第三步:若抑制剂/激动剂析出,可以将有机溶剂用充分溶胀的CMC-Na,MC等助悬剂的水溶液稀释,本步骤应注意搅拌。稀释过程中,抑制剂/激动剂会析出,并在助悬剂的作用下分散形成混悬剂。

04 Part 4 重要注意事项

1. 各助溶物的动物耐受剂量:虽然助溶剂、表面活性剂等可以有效的提高化合物在水相中的溶解度,但是大部分助溶物都有毒副作用或者可以干扰生物系统,其用量应控制在可接受的水平。

动物实验中各助溶物的使用安全范围如下表所示:

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2. 给药体积根据实验动物实际情况进行考虑,下表为为常用实验动物的生理常数及口服给药时对体积的要求

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注:对于啮齿类动物。其体重可能随饲养时间等因素存在较大差异,比如一般用于药动学试验的大鼠体重大约在200g-250g之间,但对于如肥胖症模型大鼠,其体重可达800g以上,一概而论的给药体积可能会造成偏差,所以给药体积具体根据实时动物体重来决定。

若给药体积过大:考虑对实验动物造成损伤,也可能影响动物对抑制剂/激动剂的吸收过程,如小鼠灌胃体积一般是0.1-0.8mL,按上表计算单次最大不能超过0.9mL,否则会对动物造成伤害,且数据也不准确;

若给药体积过小:很可能造成剂量不准确,影响数据的重现性。如小鼠给药建议用1mL/kg以上的给药体积,因为一只小鼠大概20g左右,采用1mL/kg的给药体积,每只小鼠的给药体积就是20µl左右,体积较小,很容易产生误差,所以可以通过降低配药浓度来提高给药体积。

3. 结合给药方式的溶剂是否需要等渗:若静脉注射则需要等渗溶液,所以配药的水相多用生理盐水而非水;而灌胃给药不要求等渗,用水就可以。

4. 配制抑制剂/激动剂溶液的稳定性:动物给药的溶液如果不进行稳定性考察,建议现配现用,以防止化合物不稳定而降解或者溶液存放冰箱时低温析出。有的化合物还需要注意避光、远离高温等。

在具体实验研究中,我们一般是不断去摸索。毕竟在动物给药实验中,我们不仅要考虑抑制剂/激动剂是否溶解,还要考虑到各种添加物质动物体内的耐受剂量范围、结合给药方式的溶剂是否需要等渗、抑制剂/激动剂是否会在体内析出、配制药液的稳定性等多方面的问题。这些都是需要依靠不断地摸索来获取经验的。

确实,在动物实验中,动物给药是一个相对而言比较繁琐的步骤。小默在这里也只能给大家一些最基础的建议,至于你手中的抑制剂/激动剂到底应该怎样才能更好地溶解,更好地发挥药效,还是建议大家在查阅相关资料外,自己动手配制少量摸索一下。

祝大家的实验都能顺顺利利,AbMole永远是真诚陪伴在你身边的抑制剂专家~


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