淋巴细胞的分离和激化
从全血中收集富含白细胞的血浆,然后通过Ficoll-Hypaque离心,沉淀细胞悬于含不同细胞分裂剂的培养基中,刺激细胞生长。
1)收集10ml全血,加入不含防腐剂的肝素(0.2ml肝素/10ml全血)。实验全过程保持无菌操作。
2)在15ml离心管中的肝素化血中加入1ml 6%葡萄糖,室温放置20~30min,沉降红细胞。沉降时间不宜过长,否则单核细胞将不再保留在富含白细胞的血浆。
3)从葡聚糖处理的血中小心收集红细胞上层的富含白细胞的血浆。
4)富含白细胞的血浆室温300g离心8min,沉淀细胞。
5)弃上清,细胞轻悬于1ml PBS中。
PBS(Dulbecco)
0.10g/L 无水CaCl2
0.20g/L KCl
0.20g/L KHPO4
0.10g/L MgCl2.6H2O
8.00g/L NaCl
2.16g/L NaH2PO4.7H2O
调pH至7.4
6)于室温下,用无菌巴斯德吸管小心将细胞悬液加在5ml Ficoll-Hypaque之上。此步操作要技术熟练,才能保持血浆曾在Ficoll-Hypaque层之间界面清晰。
7)400g低温(4℃)离心30min,沉淀细胞。离心后切记不要破坏管中的分层。
8)淋巴细胞在血浆和Ficoll-Hypaque层之间的白色浑浊条带中,小心取出贮存,弃红细胞沉淀。
9)5ml PBS洗一次细胞,室温250g离心5min,沉淀细胞悬于3~5ml生长培养基中。
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