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RNA的提取方法
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实验三 酵母RNA的提制(浓盐法) 一、目的 学习和掌握从酵母中提制RNA的原理和方法,以加深对核酸性质的认识。 二、原理 酵母含 RNA 2.67%~10.0%,DNA很少(0.03%~0.516%),而且菌体容易收集,RNA也易于分离,所以选用酵母为实验材料。 RNA提制过程是先使RNA从细胞中释放,并使它和蛋白质分离,然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质,将pH调至2.0~2.5,使RNA沉淀,进行离心收集。 提取RNA的方法很多,在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者利用稀碱溶解细胞壁,使RNA释放出来,这种方法提取时间短,但RNA在此条件下不稳定,容易分解;后者在加热的条件下,利用高浓度的盐改变细胞膜的透性,使RNA释放出来,此法易掌握,产品颜色较好。 三、仪器、试剂和材料 1.仪器 (1)量筒(50ml) (2)三角瓶(100ml) (3)烧杯(250ml,50ml,10ml) (4)布氏漏斗(40mm) (5)吸滤瓶(125ml) (6)表面皿(6cm) (7)751型分光光度计 (8)离心机(4000r/min) (9)恒温水浴 (10)药物天平 (11)烘箱 2.试剂 (l)NaCl(化学纯) (2)6mol/L HCI (3)95%乙醇(化学纯) 3.材料 鲜酵母或干酵母;pHO.5~5.0的精密试纸。 四、操作步骤 1.提取 称取鲜酵母 159或干酵母粉 2.5g,倒入 100ml三角瓶中,加 NaCl 2.5g,水25ml,搅拌均匀,置于沸水浴中提取lh。 2.分离 将上述提取液用自来水冷却后,装入大离心管内,以4000r/min离心10min,使提取液与菌体残渣等分离。 3.沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50ml烧杯内,并置入放有冰块的250ml烧杯中冷却.待冷至10℃以下时,用6mol/L HCI 小心地调节pH值至2.0~2.5(注意严格控制pH)。调好后继续于冰水中静置10min,使沉淀充分,颗粒变大。 4.洗涤和抽滤 上述悬浮液以 4000r/min离心 10min,得到 RNA沉淀。将沉淀物放在 10ml小烧杯内,用95%的乙醇 5~10ml充分搅拌洗涤,然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤,再用 95%乙醇5~10ml淋洗 3次。 5.干燥 从布氏漏斗上取下沉淀物,放在6cm表面皿上,铺成薄层,置于80℃烘箱内干燥。将干燥后的RNA制品称重,存放于干燥器内。 6.含量测定 将干燥后RNA产品配制成浓度为 10—50pg/ml的溶液,在751型分光光度 计上测定其260nm处的吸光度,按下式计算RNA含量: 式中,A260为260nm处的吸光度;L为比色杯光径(cm);0.024为lml溶液含lμg RNA的吸光度。 五、结果处理 根据含量测定的结果按下式计算提取率 六、注意事项 1.用浓盐法提取RNA时应注意掌握温度,避免在20~27℃之间停留时间过长,因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围,会使RNA降解而降低提取率。 2.加热至90~100℃使蛋白质变性,破坏两类磷酸酯酶,有利于RNA的提取。 **我们实验室一个师兄才做过,效果挺好

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