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质粒的提取
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本文主要以OMEGA试剂盒(产品编号#D6950)为例,讲述下提质粒(去内毒素)的注意事项。

DNA在化学性质上是懒惰的,但是在物理结构上是易碎的。因为在化学上其潜在的反应基团隐藏在中央螺旋部位,并苦鸡胡直井远经氢键紧密连接,同时碱双准影及硫常庆基外侧受磷酸键和戊糖形村扬成的强大环层的保护,这种保护因内在的碱基堆积力而进一步加强;在物理上,其长而弯曲,侧面来自不稳定,更容易受到柔和剪切力的破坏。双链DNA在溶液中随机卷曲,并由于预木笑编玉碱基之间的堆积作用和360问答DNA骨架上磷酸基六管建足请这响我团之间的静电排斥力而变得粘稠,所以在移液、震形渐聚荡或搅拌引起的液流中,在粘滞的盘绕物上产生的拖拉力,很容易切断双链DNA。DNA越长,破坏其所需的力越找红小,大于150kb的DNA分子在常规分离基因组DNA过程中易于断裂。

一般DNA分离提纯可以简单分为三步:
裂解宿主细胞区族屋选钟垂。如,
离子去污剂,如S述建苏题父句直耐属DS
从细胞中释放DNA,去除与DNA结合的蛋白许散势食科革胡快必号娘质并快速使胞内核酸酶失活。如,
酶水解蛋白和RNA
析液中吸收、释放DNA
利用乙醇或者异丙醇沉淀DNA去除盐离子。

菌液在高PH条件下,加入强离子去污剂(如,SDS)能够破坏细胞壁,是蛋白质与染色体DNA变形,并将质粒DNA释放到上清液中。但是在实验中关键是动作要快,因为长时间暴露在变形条件下会对闭环DNA造成不庆重歌晚而振诗才帮培可逆性。这种变性的折叠卷曲DNA不容易被限制性内切酶切割,它的琼脂糖电泳速率是线形、超螺旋和环状等天然结构DNA电泳速率的2倍,并且不容易被嵌入染料染色。碱裂法在制备治理过程中常每数元含间紧验会产生不同数量折叠形式的甚块今切DNA。上述这种方法适用于15kby以下的质粒,跳华双什助单风大于15kb的质粒在提取过程中很容易断裂,可用等渗蔗糖溶液裂解细菌,并用溶菌酶和EDTA(乙二胺四乙酸)去除细胞壁,可解决受损。产生的原生质球可通过加入去污剂(如SDS)被裂解稳投个定和黑影烧

试剂盒一般采用DNA选择性吸附稳定固相(通常是二氧化硅或者硅酸盐)的特性进行DNA纯化。在高PH、高盐缓冲液中,DNA会吸附到二氧化硅介质上面,在低盐浓度下可被洗伯武帝冷沙草脱下来。玻璃表面的阳性粒架河子随后可以在DNA骨架中磷酸负电基团和硅醇负电基团(Si-OH)之间形成盐桥,结合强度与成桥离子类型有关。一旦DNA与介质结合,他就会与其他的生物多聚物(如RNA和糖)分开。得率由DNA大小决定,片段越小,与二氧化硅结合越紧密,得率越低。

实验开始前,最主要的是细菌培养。试剂说明书建议使用DH5α,DH1,C600,都可以,XL1-Blue虽然长
的很慢但是也可以使用。其次培养基的使用建议采用LB培养基,其他的均不建议。

开始细菌培养前,最好涂板调菌培养,这样可以保持菌的活性,甘油保存的菌可能会产量低或者质粒丢失。
当挑取单菌落后放入37℃,300rpm,培养12~16h。

为了获得最佳质粒产率,起始培养体积应基于培养细菌密度。 建议使用OD600的2.0和3.0之间的细菌提取质粒。 使用富含营养素的介质时,应注意确保细菌密度不超过3.0的OD600,最后菌液OD600为0.4。 在推荐的OD范围之外使用高密度培养可能会超过纯化体系。

注意:
曝气是很重要的,LB培养基的体积应该是容器的1/4
随着培养时间的加长,由于细菌的死亡和裂解,DNA的产量开始下降。

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