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香兰素,又名香草醛,香草素,香兰醛或香茅醛,凡尼林。化学名称:4- 羟基-3- 甲氧基苯甲醛,香兰素即是一种具有代表性的广谱香料,也是重要的有机化学品中间体,在食品工业、医药工业、日化工业、烟草工业、电镀工业等领域得到了广泛的应用[1]。
目前在市场上供应的香兰素有三种,即:(1)从香子兰花荚中提取的天然香兰素;(2)用化学合成法(如愈创木酚法、木质素法、黄樟素法、丁香酚法、对羟基苯甲醛法、4-甲基愈创木酚法、对甲酚法等)生产的香兰素;(3)用微生物法生产的香兰素[2]。从香子兰花荚中提取的天然香兰素获得的香兰素为天然制品,但由于目前生产天然香兰素的方法受制于香子兰荚果供应[3]。香兰素化学生产方法有产率高的特点,目前处于香兰素合成主导地位。但是大多数化学合成的香兰素在纯度、香气、安全性等方面都亚于天然提取的香兰素,并且化学工艺产生的废弃物对环境存在很大危害。随着现代生物学的发展,微生物转化法生产天然香兰素随即成为研究焦点。
1 香兰素的合成方法
1.1 化学合成法
国内外香兰素主要来源于化学合成,根据原料的来源不同,采用不同的合成方法,主要的化学合成方法有愈创木酚法、木质素法、黄樟素法、丁香酚法、对羟基苯甲醛法、4-甲基愈创木酚法、对甲酚法等。化学合成香兰素产率非常高。但是,化学合成方法存在着许多的弊端,如以有毒的愈创木酚为原料合成香兰素易造成环境污染,并且合成香兰素的香型单一,风味容易受到杂质的影响,有的产品质量等级较低,售价相对较低。
1.2 生物合成法
相对于化学合成法,生物合成法具有周期短、不受季节和自然环境的影响、价格低廉、可批量生产安全清洁、无污染、低能耗等优点,因而生物合成法已经成为国内外的研究热点。目前国内外研究较多的生物合成法主要有:植物细胞培养法、酶法和微生物法,分述如下:
1.2.1 植物细胞培养法
通过细胞培养,直接从培养细胞的次生代谢产物中提取香兰素,可不受自然条件的限制,在人工控制条件下利用植物细胞的大量培养,可大批量生产香兰素。植物细胞培养法也有其自身限制,主要为细胞悬浮培养有细胞位置不固定、不利于细胞组织化、难以控制培养条件等缺点,因而目的产物香兰素的产量不高, 这可通过细胞固定化培养加以改善,使香兰素产量提高。
1.2.2 酶法
随着酶工程的发展进步利用酶法转化香兰素以其产物易积累、副产物少、易提纯等优点成为一个很有前景的研究方向。国内外应用酶法的研究见表1。目前可通过改善酶的性质以提高催化效率、降低成本,并使用高效、实用的反应器,使酶促反应顺利高效进行,以获得高产的天然香兰素。
1.2.3 微生物转化法
许多细菌、霉菌和酵母都可用来生产香兰素,这些微生物以阿魏酸、丁香酚、异丁香酚、香草醇、香草胺、松柏醇、蔡芦醇等化合物为前体,发酵获得香兰素[4]。从经济性来说,利用微生物发酵法生产香兰素比较实际。首先菌种生长周期短,繁殖量大,反应条件温和;其次原料丰富易得,使得香兰素的生产成本低。但是也存在香兰素产量低,产物分离复杂,不能满足工业化生产要求等问题。
2 微生物合成香兰素
2.1 可用于微生物转化法生产香兰素的菌株用于合成香兰素较多的还是真核生物,加之较强的底物针对性,对于生产过程中可逆反应的有利于合成香兰素的方向性,真核生物体现出优于原核生物的特点,成为大多数研究的出发菌株。
2.2 可用于微生物转化法生产香兰素的底物
目前能够用于合成香兰素的底物非常多,主要有丁香酚、异丁香酚,阿魏酸和葡萄糖三大类,分述如下:
2.2.1 以阿魏酸为底物
目前在微生物转化法生产香兰素的底物中以阿魏酸的研究居多,见表.3。阿魏酸广泛存在于玉米麸、谷糠等农副产物中。以阿魏酸为底物生产香兰素有两种方法:一种是单一菌转化作用,另一种是需要多菌株的联合转化。
2.2.2 以丁香酚或异丁香酚为底物
目前以丁香酚或异丁香酚为底物合成香兰素的研究见表.3。以丁香酚或异丁香酚为底物合成香兰素产率相对较低。并且,从微生物转化丁香酚或异丁香酚生产香兰素的生物转化过程均发现,丁香酚与异丁香酚对微生物有毒性,可抑制菌体生长代谢,因此筛选对丁香酚或异丁香酚耐受性强的微生物是关键之一。
2.2.3 以葡萄糖为底物
葡萄糖在大肠杆菌重组子的作用下转化为香草酸,然后香草酸经粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)中分离得到的芳醛脱氢酶还原并生成香兰素[25]。该方法底物经济、丰富、代谢途径简单可控,很有实现工业化生产的可能性。葡萄糖虽然价廉,但如何实现大肠杆菌重组子的稳定表达是实用的关键。
2.2.4 三种底物比较
从表.2 可以看到,三种底物以阿魏酸为底物的转化率相对比较高。在以阿魏酸为底物合成香兰素中又以两步法产率比较高。以葡萄糖为底物研究最少(仅LiK 等研究报道[25]),反应条件也不易控制。从我国的原料资源以及生物技术现状来看,以异丁香酚和阿魏酸为底物的生物转化法生产香兰素的技术更具发展前景。
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