找化学品上960化工网!
960化工网
酵母双杂交的优化
网友 1

最佳答案

回答者:网友

在双杂交鉴定过程中要经过两次转化,这个工作量是相当大的,特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。而且,酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。Bendixen等人通过酵母接合型的引用,避免了两次转化操作,同时又提高了双杂交的效率。在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型:a接合型和α接合型,这两种单倍体之间接合(mating)能形成二倍体,但a接合型细胞之间或α接合型细胞之间不能接合形成二倍体。根据酵母有性生殖的这一特点,他们将文库质粒转化α接合型酵母细胞,“诱饵”表达载体转化a接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔(lawn),再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上,原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。长出来的克隆进一步通过β-半乳糖苷酶活力进行鉴定。这项改进不仅简化了实验操作,而且也提高了双杂交的筛选效率。
Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统(reverse two-hybrid system)。这项技术的关键是报道基因URA3的引入。URA3基因在这里起到了反选择的作用, 它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。Vidal等人通过改造在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。然而如果目的蛋白,即与DB或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用,URA3基因不表达,则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。通过这种方法,Vidal等人筛选到了转录因子E2F1的突变物,这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB,但是丧失了同另外一种称为DP1蛋白的结合能力。结果得到了体外结合实验的验证。通过对这些突变蛋白基因的测序,他们发现了新的E2F1同DP1结合的位点。
在某些情况下,在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的,可以通过基因重组切掉转录激活域,然后重新检测其是否自激活,但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性,同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验。酵母双杂交实验转化效率太低,可以采用以下方法解决:
1) 检测一下DNA的纯度,如果可以的话,重新用乙醇纯化。
2) DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。
3) 不适当的培养基,重新配制培养基,并做对照转化。
4) 检测pGBT9对照载体的转化效率,放置于SD/–Trp平板上,转化效率应该在1 x 105 colonies/mg DNA以上。
在杂交中,预转化的诱饵细胞的数量可能不够,杂交效率不高。当对诱饵菌株进行液体培养过夜时,应挑选大的、新鲜的克隆进行培养,经过离心和重悬后,再使用血球计对细胞进行计数。


我来回答

平台客服 平台客服

平台在线客服