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回答者：网友
一、 连接反应
1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管, 编号。
2、将0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。
3、加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。
4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温8-24小时。
同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。
二、 E. coli DH5α感受态细胞的制备及转化
每组连接反应混和物各取2μl转化E. coli DH5α感受态细胞。
1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
2、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。
3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
同时做两个对照:
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
三、 重组质粒的筛选
1、每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。
2、倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。
3、放于4℃数小时,使显色完全（此步麦康凯培养基不做）。
不带有pBS质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。带有pBS载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌落。在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯选择性培养基和x-gal和ITPG培养基上均为白色菌落。
四、 酶切鉴定重组质粒
用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。使用煮沸法快速分离质粒DNA直接电泳，同时以煮沸法抽提的pBS质粒做对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS慢。再用与连接未端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选重组质粒。
