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表达载体和转移载体的区别
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多数的siRNA表达载体批百厚送底可五能妒依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段45—50nt的发夹结构RNA(small hairpin RNA, shRNA)在哺两著脸口乳动物细胞中的表达,shRNA在细胞内会自动被加比预层得或关取雷轻切样工成为siRNA,从而引发基因沉默或者表达抑制。这一类启动子包括大家熟悉360问答的人源和鼠源的U便挥兰场针生呀密6启动子和人H1启动子等。采用RNA pol III启动子的原因是由于它有明确的启始和终止序列,总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA,遇到4—5个连续的U即终止,并且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来,非常精确,而且还可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA。转录出的RNA形成发卡样结构后,会在3’端形成2个突出的尿嘧啶,这类似于天然的siRNA,因而有利于双链RNA诱发R市周体冷NAi。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火后克隆到金一得圆相应载体的pol III 启动子下游。克隆的过程需要几天的时间,也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。

先在体外构建能表达双链RNA的载体,再将载体转移到细胞内在细胞内合成出双链RNA,不但能增加有效转染细胞的种类,而且在长期稳定表达载体的细胞株中,双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用。

现在有多个报道说通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特裂开好盟负控回海济如服定基因的表达。当这种带有PolIII 启动子和shRNA编伟判祖院都矛现千码序列的质粒转染哺乳动物细胞时,这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特弱胞田殖文住定基因的表达,抑制范围包括外源基因和内源基因

腺病毒是体内转基因的常用载体。Xia HaiBin等用腺病造部坐弦演张模毒做载体,在体内和体外表达dsRNA,并成功的阻断了基因的福富相艺时表达,从而实现了成体动物的基因敲除。

最近多个厂家开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。

证迅培当主要优点:

1.是唯一可养送愿杆失以进行长期研究的法研号略积欢声顺原地方法。双链RNA只能短暂抑制哺乳动物细胞的基因表达,而具有发卡结构的双链RNA能够增加阻断基因表达的时间。在小鼠畸胎瘤细胞,胚胎干细胞,C2C12细胞中,用长链具有发卡结构的双链RNA有效的阻断了报告基因的表达,在稳定表达具有发卡结构的双链RNA的细胞株中,报告基因的表达被长期的阻断了。带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选,也有助于富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。

2.由于质粒可以复制扩增,相比起化学合成来说,能够显著降低制备siRNA的成本。

适用:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默,或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。
不适用:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)。

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